中国学者发现RA新易感基因VOPP1：基于MR分析的机制研究

方法：研究于2023年1月至2024年6月在南通大学附属医院开展，收集关节手术患者滑膜组织样本。VOPP1功能在体外通过RA成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs, fibroblast-like synoviocytes）和体内胶原诱导性关节炎（CIA, collagen-induced arthritis）大鼠模型验证。VOPP1表达水平采用定量实时PCR和Western Blot检测，并评估其对细胞增殖、炎性因子表达及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK, mitogen-activated protein kinase）信号通路激活的影响。

结果：首次证实VOPP1 eQTL可增加RA风险，且可正向调控代谢物X−23,587水平，进一步加重RA风险。VOPP1在RA滑膜组织及RA-FLSs中显著高表达，通过激活p38 MAPK信号通路促进RA-FLSs增殖和炎症反应。CIA模型中，敲低VOPP1可减轻关节损伤和滑膜炎症。

结论：VOPP1是新的RA易感基因，可能通过升高X−23,587水平并激活p38 MAPK信号通路促进疾病进展。

1. MR分析发现VOPP1是RA新易感基因

MR设计分三步：步骤1，将19,942个eQTLs作为暴露因素，RA为结局；步骤2，将1,400种代谢物作为暴露因素，RA为结局；步骤3，以VOPP1 eQTL为暴露因素，74种代谢物为结局。步骤1结果显示，具有VOPP1 eQTL遗传风险的个体RA风险升高，异质性和多效性检验无异常，敏感性分析支持这一结果。

2. VOPP1在RA滑膜组织和RA-FLSs中高表达

GSE55457数据库分析、qPCR及Western Blot均显示，RA滑膜组织VOPP1表达显著高于正常对照（NC），RA-FLSs中VOPP1蛋白水平亦显著升高。

3. 潜在机制：调控X−23,587水平

步骤2和3结果表明，VOPP1 eQTL与X−23,587代谢物水平升高显著相关，且该代谢物水平升高也增加RA风险，提示VOPP1可能通过调控X−23,587水平促进RA发生。

4. 激活p38 MAPK促进增殖与炎症

敲低VOPP1后，RA-FLSs中p-p38水平下降，加入p38 MAPK激动剂Anisomycin后部分恢复。流式细胞术和EdU实验显示，VOPP1敲低抑制细胞增殖，Anisomycin可部分逆转。ELISA检测发现，VOPP1敲低降低TNF-α和IL-6分泌，激活p38 MAPK可削弱此抑制作用，表明VOPP1依赖p38 MAPK通路促进RA-FLSs增殖与炎症反应。

5. 体内实验：敲低VOPP1减轻CIA症状

CIA模型中，注射VOPP1 siRNA显著改善关节炎指数和足肿胀，病理染色显示骨破坏、软骨退变、滑膜增生减轻，TNF-α和IL-6水平下降。

本研究遵循《流行病学观察性研究报告加强声明》（STROBE）清单，并符合MR的三大核心假设。整体MR设计包括三个步骤：步骤1以19,942个基因表达数量性状位点（eQTLs）为暴露因素，类风湿关节炎（RA）为结局；步骤2以1,400种代谢物为暴露因素，RA为结局；步骤3以VOPP1 eQTL为暴露因素，74种代谢物为结局。

2. 工具变量（IVs）筛选

步骤1使用的筛选标准为P值<5×10⁻⁸，连锁不平衡（LD）阈值为clumped kb=10,000且r²=0.001。步骤2使用相同的LD阈值，P值<1×10⁻⁵，且F统计量>10。步骤3使用相同的LD阈值，P值<5×10⁻⁸，且F统计量>10。

3. MR分析与敏感性分析

本研究采用R软件TwoSampleMR包进行双样本MR分析，主要分析方法为反向方差加权（IVW），并结合MR Egger、加权中位数、加权众数和简单众数等方法，P值<0.05为统计学显著。稳健性通过异质性检验、多效性评估和逐一排除（leave-one-out）分析验证，确保符合MR排他性假设。

4. GEO数据库分析

利用GEO数据库比较RA患者与健康人群滑膜组织中VOPP1的表达。

5. 人滑膜组织

正常滑膜组织样本（n=5）来自接受半月板关节镜手术的患者；RA滑膜组织样本（n=5）来自接受全膝关节置换术的RA患者。所有RA患者术前未接受改善病情抗风湿药（DMARDs）治疗，仅使用非甾体抗炎药（NSAIDs）控制症状。

6. 细胞分离与培养

组织切成小块，用II型胶原酶在含5% CO₂的37℃摇床中消化3小时，离心收集细胞后重悬于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，培养于37℃、5% CO₂条件下，选取3-6代RA-FLSs用于实验，并用脂多糖刺激构建体外模型。

7. 蛋白印迹（Western Blot）

总蛋白用含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取，SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，室温5%脱脂奶封闭2小时，4℃孵育一抗，洗膜后室温孵育二抗1小时，化学发光法显影，ImageJ分析条带灰度。

8. 细胞转染

VOPP1小干扰RNA（siRNA）购自GENE CREATE，序列详见原文。使用Lipofectamine 3000转染至6孔板70%融合度的细胞，48 h后收集。

9. 酶联免疫吸附试验（ELISA）

收集RA-FLSs上清及大鼠血清，按试剂盒说明检测TNF-α及IL-6水平。

10. 细胞周期与增殖检测

细胞经70%乙醇固定过夜后，PBS洗涤，染色30 min，流式细胞仪检测；EdU检测按BeyoClick EdU Kit说明进行，Hoechst染核，倒置荧光显微镜观察。

11. 统计分析

MR分析用R 4.2.1及TwoSampleMR包，细胞周期分析用NovoExpress，统计用GraphPad Prism 9.0。数据以均值±标准差（SD）表示，Shapiro–Wilk检验正态性，正态分布用t检验，非正态用Mann–Whitney U检验，P<0.05为显著差异。

遗传因素在RA的易感性中起着决定性作用。RA是一种累及全身的慢性炎症性疾病，表现为关节炎症、疼痛、肿胀及结构破坏。既往研究证实，eQTLs是挖掘潜在疾病风险基因的重要工具，为揭示RA的遗传机制和发现新靶点提供了有效途径。