找好角度，单细胞的经典思路也能上岸！！！

POP（盆腔器官脱垂）显著影响女性的健康和生活质量，目前尚无最佳治疗方法。子宫骶韧带为子宫上部和阴道提供顶端支撑，在POP中发挥着不可或缺的作用。尽管POP已被广泛研究，但其关键机制尚未完全阐明。特别是，免疫细胞（包括巨噬细胞、单核细胞、DC和中性粒细胞）在POP病理学中的作用尚不清楚。

那么今天和小伙伴们共同学习一篇发表在《CommunBiol》上的文章。这篇文章利用单细胞测序，在子宫骶韧带中测量基因表达水平，以期更深入地理解POP的发病机制。这篇文章究竟运用了哪些创新方法，又有哪些突破性的发现呢？一起来揭秘吧～

1、首次构建POP的单细胞转录组图谱。

2、本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用数据挖掘和生物信息学工具，为揭开POP的神秘面纱提供了新的指导。

题目：子宫骶韧带的单细胞分析揭示了盆腔器官脱垂女性的细胞异质性

杂志：CommunBiol

影响因子：IF=5.9

发表时间：2024.02.07

盆腔器官脱垂(POP)是女性盆腔器官（阴道、膀胱、子宫和/或直肠）因其相关支持组织薄弱而导致的移位。它是一种流行的、负担性的、限制性的疾病，会带来巨大的身体和情感不适以及巨大的经济负担。全球POP的患病率为3-6%，16个发展中国家为19.7%，中国为9.67%，美国为2.9%。而子宫骶骨韧带(USL)在POP中对子宫和上阴道的顶端支撑起着不可或缺的作用。与连接骨骼的骨骼韧带不同，USL是一种类似于肠系膜的内脏韧带，由平滑肌、血管、神经、脂肪组织和疏松结缔组织组成。

首先，作者通过scRNA测序获得POP和对照样本中的单细胞转录组图谱；其次，作者将注释到的细胞进行亚群分析和逆时序分析；最后还探索了POP和对照样本的细胞间相互作用以及转录调控。

1、POP和对照样本中的单细胞转录组图谱

作者通过scRNA测序获得了30,452个单细胞的转录组，根据标记基因，总共注释到10种细胞类型：平滑肌细胞（34.93%）、内皮细胞（21.29%）、成纤维细胞（17.36%）、中性粒细胞(4.92%)、巨噬细胞(5.36%)、单核细胞(4.05%)、肥大细胞(6.60%)、T细胞(3.70%)、B细胞(0.85%)和树突状细胞(DC)(0.94%)（如图1c）。与对照组相比，POP组巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞数量增多，内皮细胞数量明显减少，提示这些细胞在POP的病理生理机制中发挥作用（图1d)。为了了解USL中每种细胞类型的功能，作者分析了前10个DEG（图1e）并进行GO功能富集分析（补充图2）。平滑肌细胞(SMC)富含线粒体途径，而单核细胞、肥大细胞、DC和T细胞中的细胞外基质途径则下调。此外，作者还筛选了所有细胞类型中的DEG（图1f），富集分析显示，与对照样本相比，POP组的细胞类型在含胶原ECM、肌肉系统过程、中性粒细胞激活等相关通路中富集，令人惊讶的是，SMC下调了ECM组织途径（补充图3）。

2、基质细胞的表征

基质细胞是USL中的主要细胞，占细胞群的73.58%，因此作者对三种类型的基质细胞（成纤维细胞（图2）、平滑肌细胞（图3a-3f）、内皮细胞（图3g-3j））进行了亚群分析和逆时序分析。

成纤维细胞被标记为S3FRP1+成纤维细胞、FGBP2+成纤维细胞、PCP4+肌成纤维细胞、PGS5+壁细胞和SLPI+成纤维细胞（图2a），且POP中PCP4+肌成纤维细胞减少，其他簇的比例没有显著变化（图2c），富集分析发现PCP4+肌成纤维细胞高表达肌肉收缩相关基因，例如ACTA2和ACTG2。

SMC被分为四个细胞簇（图3a），分别是SMCs1（ATF3 +SMCs）、SMCs2（暂时标记为CTR9 +SMCs）、SMCs3（CFHR1 +SMCs），与正常组织相比，POP中SMCs2的比例显著增加，而SMCs3的比例下降（图3b），且CFHR1 +SMCs在免疫效应过程途径的调节中富集。

内皮细胞被分为淋巴内皮细胞（LEC）、动脉内皮细胞（AEC）和静脉内皮细胞（VEC）（图3g），POP组中AEC的比例增加（图3h)，作者还发现AEC在肌动蛋白结合途径中富集。

3、骨髓细胞的表征

POP组和对照组之间的免疫细胞浸润类型存在显著差异。除USL中的基质细胞外，骨髓细胞是最大的细胞群。POP组中巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞增加（图1d）。

通过巨噬细胞的无监督聚类分析获得了四个聚类，它们都高度表达应激反应基因，例如DNAJB1、HSPA1A、HSPA1B和一些细胞因子基因。按比例来看，POP样本中巨噬细胞1、2和4显著增加，而巨噬细胞3显著减少（图4b)。富集分析表明巨噬细胞3可能是M1亚型，中性粒细胞活化和白细胞趋化等途径在巨噬细胞3中富集（图4d）,GO功能富集分析表明，巨噬细胞1富集了应激相关通路，巨噬细胞2富集了脂蛋白颗粒结合和细胞基质粘附通路（图4d)。第四个簇只有22个细胞和高表达的CHIT1，这是与纤维化相关的巨噬细胞激活的标志物。

单核细胞分为四个簇（图4e），POP样本中单核细胞1显著增加，单核细胞3、4显著减少（图4f-g)。作者发现几乎所有单核细胞都表达CD14，只有单核细胞3表达CD16/FCGR3A（补充图5）。据此认为单核细胞3是中间单核细胞（CD14+CD16+），其余的是经典单核细胞（CD14+ CD16-/低）。单核细胞3在氧化磷酸化、RNA分解代谢过程和中性粒细胞激活途径中富集（图4h），单核细胞1高表达IRAK2、CD72和CCL20等炎症相关基因，并富含I-kappaB激酶/NF-kappaB信号、内在凋亡信号通路等（图4h）。单核细胞2高表达JUN、FOS和ATF3转录因子和早期反应基因家族（EGR1、IER2），这些基因在应激相关通路中富集。单核细胞4主要富集于金属离子反应。

此外，逆时序分析显示了从经典单核细胞到中间单核细胞，然后到巨噬细胞或DC的发育轨迹。另外IL1RN、IL1B和CCL20在逆时序开始时上调，FOS、JUN和补体相关基因（C1QA、C1QB和C1QC）在接近结束时上调（图5c）。RNA速度分析表明单核细胞和巨噬细胞都有指向DC的RNA速度向量（图5d）。

对POP组中的中性粒细胞的进一步分析揭示了四个具有不同基因表达谱的簇（图5e）。POP组中性粒细胞数量增加（图5f）。进一步作者发现中性粒细胞1具有G2-5a亚群的特征，中性粒细胞2符合G5c亚群，中性粒细胞3符合G5b亚群。

4、POP和对照样品中的细胞间相互作用模式

细胞间相互作用分析表明，在基质细胞中观察到成纤维细胞和内皮细胞之间的强烈相互作用（图6a），在免疫细胞中观察到中性粒细胞、巨噬细胞、DC和单核细胞之间存在密集的通讯网络。此外，还分别鉴定了对照组和POP组中的受体-配体对（图6b-c），与对照组相比，POP组的细胞间相互作用减弱，尤其是成纤维细胞与EC、中性粒细胞和MP之间的相互作用（图6d）。

因此，作者探索了EC和成纤维细胞之间的特定相互作用（图6e）。对照组中，成纤维细胞分泌大量MMP2、FN1、LAMC1和OMD等胶原蛋白样基因与内皮细胞相互作用。此外，EPHB4_EFNB1、FLT1复合物_PGF、VEGFA_FLT1和VEGFD_KDR受体-配体对促进内皮细胞生长。EC和成纤维细胞通过FGFR1_FGF7和FGFR1_NCAM1受体-配体对促进成纤维细胞生长和发育。

与对照组相比，POP组USL中性粒细胞显著增加（图1d），并且中性粒细胞和单核吞噬细胞之间存在丰富的细胞通讯网络。

5、POP和对照样本中的转录调控

最后，作者使用单细胞转录因子调控网络分析来评估USL中TF的表达并识别关键TF。巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞中高表达的NFATC2，肥大细胞和T细胞中高表达的GATA3，T细胞中高表达的STAT4均能促进T细胞分化（图7a）。对这些TF进行GO功能富集分析，发现MYBL2、GATA3和ARID3A在淋巴细胞分化和髓系白细胞分化调节方面富集（图7b）。此外，作者还研究了POP组中的TF。中性粒细胞特异性TF与对照组相同，然而，表达强度显著增强（图7a-b）。单核细胞的几种特定转录因子，如OLIG1、CEBPE、POU2F2和NFE2，均在中性粒细胞激活中富集（图7c-d）。对照组和POP组的基质细胞的TF在功能上趋于相似，并且都与特定细胞的发育、分化和增殖有关。

此研究首次利用scRNA-seq探索POP和正常USL的细胞类型组成和异质性，揭示了POP样本USL组织中免疫细胞浸润的景观。作者发现了成纤维细胞和内皮细胞相互促进生长、增殖和发育，描述了免疫细胞和成纤维细胞如何通过受体-配体对相互沟通。此外，还发现了调节ECM、细胞发育和免疫反应的重要TF。这篇文章的单细胞分析的思路很经典，对一些分析结果的可视化的解读非常具体，所以对这些可视化的解读有疑虑的小伙伴们快来看看吧！