GEO数据库+机器学习+RT-qPCR轻松拿下一“城”

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 复发性流产是指在妊娠20-24周之前发生两次或两次以上流产，是影响人类生殖健康的一种普遍且重要的病理状况。然而，RPL的潜在机制仍不清楚。本研究旨在研究与RPL相关的生物标志物和分子机制，并探索临床应用的新治疗策略。

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作者利用GEO数据库检索RPL基因表达谱并进行差异表达分析、WGCNA、功能富集以及使用LASSO回归、SVM-RFE和随机森林对RPL基因表达进行分析；构建ANN模型来评估数据集中hub基因的性能；通过RT-qPCR来验证RPL和对照组中hub基因的表达；接着进行免疫细胞浸润、泛癌分析，并使用CMap进行小分子药物筛选，流程见图1。

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1、RPL中的DEG鉴定、功能富集及WGCNA分析

对GSE165004进行差异表达分析，共获得198个上调基因和154个下调基因（图2A）。接着，作者针对DEG做了GO、KEGG、GSEA富集分析，结果表明了代谢途径紊乱可能与RPL发病机制有密切关系。然后，作者从GSE165004中总共选择了20,552个基因进行WGCNA，结果显示，turquoise模块与RPL关系最密切（r=-0.42，p=0.003）（图3E），共包含1,990个基因。

2、枢纽生物标志物的鉴定

turquoise模块中总共包含104个DEG，LASSO回归提取了3个hub基因（WBP11、ACTR2和NCSTN）（图4A、B）；SVM-RFE筛选WBP11、SUGT1、CISD2、ACTR2、C2orf69和NCSTN作为中心特征（图4C、D）；随机森林确定了7个重要性得分>1.0的基因作为RPL的潜在诊断生物标志物：WBP11、ACTR2、SUGT1、NCSTN、C2orf69CISD2和DHX33（图4E、F），这三种算法（ACTR2、NCSTN和WBP11）之间有3个生物标志物重叠（图4G）。基于三个hub基因构建了人工神经网络模型（图4H）。

3、中枢生物标志物和ANN模型的诊断功效

使用ROC曲线评估3个hub基因的诊断功效。如图所示，在测试集GSE165004和验证集GSE183555中，WBP11的AUC值为1.00和0.60（图5A）。ACTR2的AUC值为0.99和0.60（图5B），NCSTN的值为0.99和0.52（图5C）。ROC结果表明，ANN模型可以有效区分RPL和对照，测试集GSE165004的AUC值为1.00，验证集GSE183555的AUC值为0.74（图5D）。这些发现表明，三种生物标志物的联合使用有助于提高诊断准确性。

4、中心生物标志物的验证

为了验证hub基因的mRNA和蛋白表达，作者收集了20名对照患者和20名RPL患者的蜕膜样本。RT-qPCR结果显示，RPL组WBP11mRNA相对表达量低于对照组（图6A）。ACTR2mRNA的相对表达量也低于对照组，而NCSTNmRNA的相对表达量高于对照组（图6B、C）。

5、免疫细胞浸润结果

作者使用CIBERSORT进一步研究了RPL和对照组中的免疫细胞浸润（图7A）。与对照组相比，RPL组M1和M2巨噬细胞的浸润水平显著降低（图7B）。值得注意的是，结果中未检测到CD4初始T细胞和活化肥大细胞的浸润。相关分析显示，嗜酸性粒细胞与静息肥大细胞呈强正相关（r=0.74），而M0巨噬细胞与M2巨噬细胞呈负相关（r=-0.59）。图7C）。使用Spearman相关分析进一步研究了三个hub基因与免疫细胞之间的关系。结果表明，WBP11与M2巨噬细胞呈正相关，而与滤泡辅助T细胞、活化NK细胞和调节性T细胞(Treg)呈负相关。图8A、D-G）。ACTR2与M1巨噬细胞呈正相关（图8B、H）。NCSTN与CD8T细胞和Tregs呈正相关，与活化的树突状细胞和M2巨噬细胞呈负相关（图8C，I-M）。

6、Hub生物标志物的泛癌分析结果

从不同的样品中提取三个hub基因的表达数据并进行分析。发现WBP11在24种肿瘤类型（GBM、GBMLGG、LGG、BRCA、CESC、ESCA、STES、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、OV、PAAD、TGCT、UCS、ALL、LAML、ACC和CHOL），并且在LUAD、KIRP和THCA中显著下调（图9A）。使用Cox回归显示，LAML和LUAD中WBP11高表达与预后不良相关，而KIRC和READ中WBP11低表达与不良预后相关（图9C-F）。

ACTR2在28种肿瘤类型（GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、BRCA、CESC、LUAD、ESCA、STES、KIPAN、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、BLCA）中表现出高表达、THCA、OV、PAAD、TGCT、UCS、LAML、CHOL），而KIRP和KICH中观察到低表达（补充图2A）。在GBMLGG、LGG、LAML、CESC、LUAD、KIRP、KIPAN、LIHC、MESO、PAAD、LAML和ACC中，ACTR2充当危险因素，而在KIRC和NB中充当保护因素（补充图2B-F）。

NCSTN基因表达在30种肿瘤类型中上调，包括GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、BRCA、CESC、LUAD、ESCA、STES、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、BLCA、THCA、OV、PAAD、TGCT、UCS、ALL、LAML、PCPG、ACC和CHOL，而在KICH中显著下调（补充图3A）。在预后分析中，NCSTN的高表达与GBMLGG、LGG、LAML、CESC、LUAD、KIRP、KIPAN、GBM、LIHC、UVM、LAML和PCPG等12种癌症的总生存率较差相关（补充图3B-F）。

7、RPL相关小分子药物

使用CMap，作者研究了与RPL相关的小分子药物，并鉴定了总共17种化合物。表4显示与RPL相关性最高的前10种药物。值得注意的是，乙酸胍和阿多拉嗪与RPL表现出很强的负相关性，表明它们在治疗这种疾病方面的潜在价值。

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这篇文章利用GEO数据库、机器学习、WGCNA以及RT-qPCR确定了WBP11、ACTR2和NCSTN为RPL的诊断生物标志物，并且这三个hub基因与各种恶性肿瘤密切相关。同时，RPL中免疫细胞浸润存在不平衡，并为RPL的潜在机制以及该疾病治疗靶点的潜在开发提供了新的见解。性价比极高的一篇高分文章，大家赶紧学起来吧！